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本试剂盒采用特制的分离介质和优化的提取步骤，简单快速的从细菌培养物中提取细菌脂多糖（LPS）。提取液简单处理细菌细胞壁（外膜）后，使细胞壁（外膜）破裂，释放出脂多糖至介质中。

本试剂盒具有高回收率，提取产量高，省时，蛋白质、核酸和多糖污染低，确保提取的脂多糖具有较高的纯度和生物活性。本试剂盒对S型、R型脂多糖均可有效提取。

• 试剂瓶开盖后各组分按要求条件保存。
  
• 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，拆封后请尽快使用完。

• 适用性广，能从所有革兰氏阴性菌中提取脂多糖。
  
• 操作简单方便。
  
• 提取脂多糖下游应用广，包括直接用于免疫刺激。

本提取试剂盒适用于多种革兰氏阴性细菌的脂多糖提取，包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、弯曲杆菌、百日咳鲍特菌等。无论是从培养的细菌细胞中提取脂多糖，还是从环境样本中提取脂多糖，都能提供可靠的提取效果。提取的脂多糖经处理后可以满足各种下游实验的需求，例如细胞处理、动物处理、活性检测、ELISA、细胞因子测定等下游应用。

• 微生物学实验：
  研究革兰氏阴性细菌的感染机制。
  分析不同细菌LPS的结构和功能差异。
  
• 免疫学实验：
  研究LPS与宿主免疫系统的相互作用。
  分析LPS诱导的免疫反应，如细胞因子释放。
  
• 生物医学研究实验：
  探索LPS在脓毒症和炎症性肠病等疾病发展中的作用。
  研究LPS与细胞信号传导和炎症反应的关系。
  
• 药物开发实验：
  筛选和评估抗LPS或抗炎药物。
  研究药物对LPS诱导的细胞反应的影响。
  
• 环境科学实验：
  检测水体或土壤样本中的LPS，评估环境污染状况。
  研究环境中革兰氏阴性细菌的分布和生态影响。
  
• 食品安全实验（研发过程用）：
  研发检测食品样本中的LPS的方法，评估食品的安全性和卫生状况。
  研究食品加工过程中LPS的去除方法。
  
• 临床诊断实验室（研发过程用）：
  研究开发基于LPS检测的诊断方法，如脓毒症的早期诊断试剂研发。

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分，结构很复杂、热稳定性极高（在250℃下干热灭菌2h才完全灭活）。受脂多糖发现的历史原因，如今脂多糖的概念几乎等同于内毒素（endotoxin）。脂多糖由多糖链和脂质A组成，不同细菌间的多糖链是高度变化的，决定细菌的血清型；而脂质A主要影响脂多糖的毒性作用。脂多糖可以引起免疫刺激的级联反应和机体的毒性病理生理活动，包括释放内毒素引起感染性休克从而导致末梢血管虚脱。临床常通过检测脂多糖的存在来诊断脑膜炎。

由于脂多糖与机体免疫机能的密切关系，生命科学研究常常提取脂多糖进行相关的研究，如阐明脂多糖的结构，代谢，免疫学，生理学，毒性，生物合成途径；诱导生长促进因子如白介素的合成与分泌；诱导疾病研究的动物模型如炎症反应，急性肺损伤。

• 仪器准备：离心机、振荡器、涡旋混匀器、超声破碎仪、移液器、冰箱、冰盒
  
• 试剂准备：生理盐水
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套

• 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（rpm）两种表示方式，有些离心机设置有rpm和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
  
  g＝r×1.118×10^-5×rpm²
  
  其中r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米。例如：转速为3000rpm，有效离心半径为10cm，则，
  
  相对离心力(RCF,×g)＝10×1.118×10^-5×3000²＝1006.2
• 可以用试剂盒或者苯酚硫酸法进行脂多糖定量，或者用鲎试剂进行检测。
  
• 以下操作步骤中各步的温度均须确保按说明书要求，这是有效提取得到高质量脂多糖的关键环节。

• 室温8000×g离心10分钟收获细菌细胞。
  
  • 需培养至对数生长期后期的样本。
• 用2～8℃生理盐水洗涤菌体一次。离心收集菌体沉淀。
  
• 在沉淀中加入500μL 2～8℃的试剂A重悬细菌，8000×g离心10分钟，弃上清，留沉淀。
  
  • 每次处理50mg～200mg湿重菌体均可。
• 在沉淀中加入500μL 2～8℃的试剂A重悬沉淀，8000×g离心5分钟，弃上清，留沉淀。
  
• 在沉淀中加入500μL提取液B，充分重悬沉淀。
  
  • 涡旋至完全重悬，无块状菌体。
• 在150～300w超声10秒间隔10秒，超声5～10分钟。
  
  • 没有超声条件可以不超声。
    
  • 如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率过大，需要降低功率。
    
  • 避免产生泡沫。
• 在66～68℃水浴或气浴/金属浴孵育5分钟。
  
• 在提取液B中加入66～68℃预热的500μL提取液C，剧烈涡旋20秒充分混匀。
  
• 在66～68℃条件下振荡30分钟。
  
  • 全程保持温度66～68℃一致，避免温度明显波动。
    
  • 没有振荡条件可以66～68℃静置，中间隔10分钟用移液器轻轻吹打混匀。
    
  • 常规菌株（如大肠杆菌、沙门氏菌、某些弧菌等）均可以用此温度。特殊难提取菌株（如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌）建议将温度调整到用70～75℃，以提到LPS回收率。有荚膜菌株需要超声处理。
    
  • 常规菌株不要使用68℃以上的高温，避免O-抗原链的断裂。若你的实验核心是利用LPS的生物活性（如诱导细胞因子分泌、检测内毒素毒性）：此步使用66～68℃。若你的实验核心是获取更多LPS总量（如后续纯化后做结构鉴定、定量分析），对活性没有要求，可以使用70～75℃。
• 将提取液离心管取出，立即放入冰水浴中快速冷却至约4℃。
  
• 在4℃，12000×g离心30～60分钟。
  
  • 此时溶液会分层，上层为透明水相。
• 小心吸取最上层上清至另一干净离心管，即得脂多糖样品。
  
  • 避免触碰中层沉淀，此步骤需轻柔，减少杂质带入。
    
  • 样品中含有高盐。如果有需要可以透析或超滤脱盐后再用于下游实验。
    
  • 透析或超滤脱盐后冻干称重，根据需要溶解到合适浓度用于下游实验。

• 提取的LPS如何处理，如何检测？
  提取得到的LPS样品可以用3.5 KD的透析/超滤脱盐管处理后冻干称重，根据需要溶解到合适浓度用于下游实验。
  内毒素活性检测用鲎试验（LAL）法。
  简单定性检测可以用SDS-PAGE电泳银染法。注意SDS上样缓冲液不要煮沸，避免破坏结构。
  有合适抗体的话可以做WB或ELISA。
  有条件可以做细胞刺激实验、动物发热实验。
  
• 提取的LPS纯度低，含有蛋白污染？
  试剂盒已含有去除蛋白质的试剂，如果对蛋白质杂质要求极高的应用，可以再次纯化。
  在最后一步得到的上层中加入等体积的试剂C混匀，重复第7～11步。
  也可以将最后一步得到的上层清液用蛋白酶处理，在透析后进行酶消化：加入DNase I和RNase A（终浓度各约20～50μg/mL）。再加入蛋白酶K（终浓度50～100μg/mL），继续在37℃下孵育2～4小时或过夜。
  还要注意各步骤的温度和离心力需要达到。
  
• 提取的LPS量少，回收率偏低？
  可以将最后一步吸取上层上清后的中下层液体再次抽提，在中下层液体中加入等体积的试剂B充分混匀，重复第8～11步。将第一次和第二次收集的上层上清合并。
  也有可能原因是菌体收集时机不当，未到对数生长期后期（OD600＜1.0），菌体总量不足。解决方案是调整培养时间，待菌液OD600达到1.0-1.2时离心收集，确保菌体沉淀量≥0.5g（50mL菌液）。
  还要注意各步骤的温度和离心力需要达到。
  
• LPS活性较低？
  如果LPS活性受损（鲎试剂试验检测值低），可能是第7～9步温度偏高，导致LPS的O-抗原链断裂。需要严格控制水浴温度在68℃，振荡处理，避免局部温度过高。温度不能超过75℃。
  冻干过程中温度过低（＜-50℃），LPS结构会破坏。调整冷冻干燥机参数，预冻温度设为- 40℃，保持2小时后再抽真空，避免快速冷冻导致结构破坏。
  也有可能储存不当，LPS不能反复冻融。冻干后立即分装为100μg/管，-20℃密封保存，每次使用时取1管，避免反复冻融。